利用層析柱將混合物各組分分離開(kāi)來(lái)的操作過(guò)程稱(chēng)為柱層析。柱層析是層析技術(shù)中的一類(lèi)，依據(jù)其作用原理又可分為吸附柱層析(原理見(jiàn)第97～100頁(yè)和第101～102頁(yè))、分配柱層析(原理見(jiàn)第91～92及94～95頁(yè))和離子交換柱層析等。其中以吸附柱層析應(yīng)用**廣。以下只介紹吸附柱層析的相關(guān)問(wèn)題，其操作方法也可作為其他類(lèi)型柱層析的參考。  

1.吸附柱層析的器材(1)層析柱  

實(shí)驗(yàn)室中所用的玻璃層析柱有兩種形式：一是下部帶有活塞的玻璃管，如圖3-3**所示，活塞的芯**好是聚四氟乙烯制作的，這樣可以不涂真空油脂，以免污染產(chǎn)品。如果使用普通的玻璃活塞，則真空油脂要小心地涂薄涂勻。另一種是將玻璃管下端拉細(xì)，套上一段彈性良好的管子。這段管子必須是不能被淋洗劑溶解的，普通橡皮管一般不可充作此用，因?yàn)橄鹌ひ妆宦确?、苯、THF等溶劑溶脹，而聚乙烯管子對(duì)大多數(shù)溶劑是惰性的，所以常常使用。用一只螺旋夾控制流速，如圖3-35b所示。此外，薄膜塑料柱如圖3-35c，因使用方便、節(jié)省淋洗劑、減少蒸發(fā)量等優(yōu)點(diǎn)，應(yīng)用日趨廣泛。薄膜塑料柱總是以扁平成卷保存的，兩側(cè)常有很深的折痕。使用前需將裁取的一段薄膜管一端扎緊，另一端套在一段玻璃管上并用棉線扎緊。將這段玻璃管穿過(guò)一個(gè)單孔塞。然后將薄膜管放進(jìn)一根又粗又長(zhǎng)，下端拉細(xì)了的玻璃管內(nèi)，使塞子塞緊大玻璃管的口。用水泵自大玻璃管下端抽氣，薄膜柱即因內(nèi)部壓強(qiáng)大于外部而自行展圓。待裝入吸附劑后在其下部扎幾個(gè)小孔即可使用。 

層析柱的尺寸根據(jù)被分離物的量來(lái)確定，其直徑與高度之比則根據(jù)被分離混合物的分離難易而定，一般在1∶8到1∶50之間。柱身細(xì)長(zhǎng)，分離效果好，但可分離的量小，且分離所需時(shí)間長(zhǎng)；柱身短粗，分離效果較差，但一次可以分離較多的樣品，且所需時(shí)間短。如果待分離物各組分較難分離，宜選用細(xì)長(zhǎng)的柱子，如果要處理大量的較易分離的或?qū)Ψ蛛x純度要求較低的混合物，則可選用粗而短的柱子。**常使用的層析柱，直徑與長(zhǎng)度之比在1∶8到1∶15之間。

(2)吸附劑

柱層析中**常使用的吸附劑是氧化鋁或硅膠。其用量為被分離樣品的30～50倍，對(duì)于難以分離的混合物，吸附劑的用量可達(dá)100倍或更高。對(duì)于吸附劑應(yīng)綜合考慮其種類(lèi)、酸堿性、粒度及活性等因素，**后用實(shí)驗(yàn)方法選擇和確定。市售氧化鋁有酸性、堿性和中性之分。酸性氧化鋁是用1%鹽酸浸泡后，用蒸餾水洗到其浸出液的pH值為4，適用于分離酸性物質(zhì)；堿性氧化鋁浸出液的pH值為9～10，用以分離胺類(lèi)、生物堿及其他有機(jī)堿性化合物。中性氧化鋁的相應(yīng)pH值為7.5，適合于醛、酮、醌、酯等類(lèi)化合物的分離以及對(duì)酸、堿敏感的其他類(lèi)型化合物的分離。硅膠沒(méi)有酸堿性之分，可適用于各類(lèi)有機(jī)物的分離。柱層析所用氧化鋁的粒度一般為100～150目，硅膠為60～100目，如果顆粒太小，淋洗劑在其中流動(dòng)太慢，甚**流不出來(lái)。  

氧化鋁和硅膠的活性各分五個(gè)等級(jí)(見(jiàn)表2-5)。哪個(gè)活性級(jí)別分離效果**好，要用實(shí)驗(yàn)方法確定，而不是盲目選擇高的活性級(jí)別，**常使用的是Ⅱ～Ⅲ級(jí)。如果吸附劑活性太低，分離效果不好，可通過(guò)“活化”來(lái)提高其活性。所謂“活化”就是指用加熱的方法除去吸附劑所含的水分，提高其吸附活性的過(guò)程。通常是將吸附劑裝在瓷盤(pán)里放進(jìn)烘箱中恒溫加熱。“活化”的溫度和時(shí)間應(yīng)根據(jù)分離需要而定。氧化鋁一般在200℃恒溫4h，硅膠在105～110℃恒溫0.5～1h。“活化”完畢，切斷電源，待溫度降**接近室溫時(shí)，從烘箱中取出放進(jìn)干燥器中備用。有的樣品在活性高的吸附劑中分離效果不好，可將吸附劑放在空氣中讓其吸收一些水分，分離效果反而好一些。 

此外，一些天然產(chǎn)物帶有多種官能團(tuán)，對(duì)微弱的酸堿性都很敏感，則可用纖維素、淀粉或糖類(lèi)作吸附劑?；钚蕴际且环N吸附能力很高的吸附劑，但因粒度太小而不常用。  

(3)淋洗劑

淋洗劑是將被分離物從吸附劑上洗脫下來(lái)所用的溶劑，所以也稱(chēng)為洗脫劑或簡(jiǎn)稱(chēng)溶劑。其極性大小和對(duì)被分離物各組分的溶解度大小對(duì)于分離效果非常重要。如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)大于被分離物的極性，則淋洗劑將受到吸附劑的強(qiáng)烈吸附，從而將原來(lái)被吸附的待分離物“頂替”下來(lái)，隨多余的淋洗劑沖下而起不到分離作用；如果淋洗劑的極性遠(yuǎn)小于各組分的極性，則各組分被吸附劑強(qiáng)烈吸附而留在固定相中，不能隨流動(dòng)相向下移動(dòng)，也不能達(dá)到分離的目的。如果淋洗劑對(duì)于被分離物各組分溶解度太大，被分離物將會(huì)過(guò)多、過(guò)快地溶解于其中并被迅速洗脫而不能很好地分離；如果溶解度太小，則會(huì)造成譜帶分散，甚***不能分開(kāi)。常用溶劑的極性大小次序也因所用吸附劑的種類(lèi)不同而不盡相同，第99～100頁(yè)給出了在硅膠和氧化鋁柱中常用溶劑所表現(xiàn)出的極性次序，可作為選擇溶劑的參考，首先在薄層層析板上試選(見(jiàn)圖3-40)，初步確定后再上柱分離。如果所有色帶都行進(jìn)甚慢則應(yīng)改用極性較大溶解性能也較大的溶劑，反之則改用極性和溶解性都較小的溶劑，直**獲得滿(mǎn)意的分離效果。